Mức độ kháng hóa chất diệt côn trùng nhóm pyrethroides của nhóm loài muỗi Anopheles maculatus

Mức độ kháng hóa chất diệt côn trùng nhóm pyrethroidescủa nhóm loài muỗi Anopheles maculatus

Resistance of insecticide Pyrethroides of the Anopheles maculatus group

Hồ Viết Hiếu1, Nguyễn Thị Duyên2

1Trung tâm Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển, Trường Đại học Duy Tân

Center for Molecular Biology, Institute of Research and Development, Duy Tan University

2Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng, Quy Nhơn

Insitute of Malariology, Parasitology and Entomology, Quy Nhon

 

Tóm tắt

Trong nghiên cứu này, chúng tôi báo cáo tóm tắt các kết quả nghiên cứu về mức độ nhạy cảm của nhóm loài muỗi An. maculatus với nhóm hóa chất diệt côn trùng pyrethroides là α-cypermethrine và λ-cyhalothrin ở bốn địa phương thuộc khu vực miền Trung và Tây Nguyên. Nhóm loài muỗi này đã kháng hoặc tăng tính chịu đựng với hai loại hóa chất này dựa trên các phân tích về thử sinh học theo công thức của WHO hoặc bằng phương pháp điện di và nhuộm màu isozyme esterase.

Từ khóa: Anopheles maculatus, điện di enzyme SDS PAGE, isozyme esterase, muỗi kháng hóa chất, sốt rét

Abstract

This report presents the findings of insecticide resistance of the An. maculatus group. Two pyrethroide compounds, α-cypermethrine and λ-cyhalothrin, were used to test the insecticide resistance of An. maculatus group collected in four locations belonging to the Central and Highlands of Vietnam. As a result, the An. maculatus group were resistant or increased tolerance with these compounds based on the WHO bioassays and enzyme SDS PAGE.

Key words:Anopheles maculatus, enzyme SDS PAGE, insecticide resistance, malaria.

  1. Mở đầu

Theo thông báo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trong số 200 loài động vật chân đốt có tầm quan trọng về y học kháng hóa chất có tới 50% là muỗi truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết và giun chỉ [11,12]. Ở Thái Lan, nhóm loài An. maculatus là vector chính truyền bệnh sốt rét,phức hợp loài An. maculatus gồm có 10 loài, trong đó đã xác định được hai loài là: An. maculatus An. sawadwongporni là các vector chính truyền bệnh sốt rét. Phức hợp loài An. maculatus tại Việt Nam đã xác định 06 loài trong phức hợp loài đồng hình và đã xác định được một loài trong phức hợp này là: An. sawadwongporni là vector chính truyền bệnh sốt rét [1].

Theo thống kê, trong năm 2000 cả nước có 293.016 ca mắc bệnh sốt rét, trong đó có 148 ca tử vong, thì đến năm 2008, số ca sốt rét đã giảm xuống còn 19.485 ca trong đó có 14 ca tử vong. Thu được kết quả khả quan này do sự đóng góp tích cực của hoạt động nghiên cứu và phòng chống các vectortruyền bệnh sốt rét. Tuy nhiên,do ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc, muỗi thay đổi tập tính, muỗi sống ngoài nhà và tăng sức chịu đựng với hóa chất diệt côn trùng, cùng với việc di dân biến động lớn và khả năng đầu tư cho chương trình phòng chống bệnh sốt rét còn nhiều hạn chế đã làm ảnh hưởng đến chiến lược phòng chống bệnh sốt rét.

Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu đánh giá độ nhạy cảm của phức hợp loài muỗi An.maculatus với hóa chất diệt côn trùng dựa trên kỹ thuật thử sinh học và điện di enzyme liên quan đến tính kháng hóa chất diệt côn trùng ở muỗi An. maculatus,vector phụ truyền sốt rét, ở khu vực trung du miền núi trên toàn quốc là cần thiết nhằm lựa chọn các biện pháp phòng chống thích hợp, tránh lãng phí và gây ô nhiễm môi trường. Trong phạm vi của nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành đánh giá mức độ nhạy cảm của nhóm loài muỗi An. maculatus đối với hai hóa chất diệt côn trùng là α-cypermethrine và λ-cyhalothrin tại bốn địa phương thuộc khu vực miền Trung và Tây Nguyên.

  1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.  Đối tượng

Từ kết quả điều tra côn trùng (số liệu không công bố ở bài báo này), chúng tôi đã lựa chọn nhóm loài muỗi Anopheles maculatusđể thử nghiệm trong nghiên cứu này.

2.2.  Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trong hai năm 2011 và 2012 tại 4 tỉnh là Bình Định, Phú Yên, Quảng Trị (3 tỉnh miền Trung) và Đắc Lắc (Tây Nguyên).

2.3.  Hóa chất

Hai hóa chất diệt côn trùng nhóm pyrethroides là α-cypermethrine và λ-cyhalothrin được sử dụng để thử nghiệm.

Alpha- cypermethrin

Tên thương phẩm: Fendona.

Tên thông thường : alpha – cypermethrin, alphamethrin.

Công thức hoá học: C22H19Cl2NO3 = 416

Dạng hoá chất: Dạng huyền phù đậm đặc 10SC (suspension concentrate).

Liều sử dụng Trong phòng chống muỗi sốt rét tẩm màn liều 25mg/m2, phun tồn lưu liều 30 mg/m2.

Thời gian tồn lưu: trên màn tẩm : 6-10 tháng, trên tường phun : 6-9 tháng

Lamda-cyhalothrin

Tên thương phẩm: Icon

Công thức hoá học: C23H19ClF3NO3 = 449,9

Dạng hoá chất: Dạng huyền phù nang 2,5CS (capsule suspension ), dạng bột thấm nước 10WP (wettable powder)

Tính chất lý học: Rất ít tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ. Sử dụng với liều lượng 30mg/m2 để diệt muỗi sốt rét.

Thời gian tồn lưu   trên màn tẩm : 6-10 tháng , 7- 9 tháng trên các loại vách gỗ, nứa, tồn lưu kém trên tường vôi (dưới 1 tháng).

2.4.  Phương pháp thử nhạy cảm ở muỗi

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thử nhạy kháng ở muỗi của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm1998 [13,14], được tóm tắt như sau:

-            Điều kiện thử nghiệm: điều kiện thử nghiệm lý tưởng là muỗi cái thử nghiệm chưa hút máu, 1-2 ngày tuổi, khoẻ mạnh. Mỗi công thức thử nghiệm sử dụng 100 cá thể. Điều kiện phòng thử nghiệm: nhiệt độ 25 ± 2°C và độ ẩm tương đối là 70 - 80%. Những con muỗi còn bay được được tính là muỗi sống.

-           Chuẩn bị các ống nghỉ: lót các tờ giấy có kích thước bằng ½ tờ giấy A4 vào bên trong ống nghỉ, dùng các vòng bằng thép ép giấy sát vào trong thành ống. Cho từ 20 - 25 con muỗi đã chọn vào trong một ống nghỉ. Để muỗi nghỉ 1 giờ, sau đó kiểm tra lại và loại bỏ những con muỗi không đạt yêu cầu, bổ sung thêm muỗi cho đủ số lượng.

-           Chuẩn bị ống đối chứng và ống thử nghiệm: lót các tờ giấy đối chứng vào trong ống đối chứng và các tờ giấy có tẩm hoá chất vào trong ống thử nghiệm. Dùng các vòng bằng kim loại ép sát tờ giấy vào thành ống.

-           Cho muỗi tiếp xúc với giấy tẩm hoá chất: lắp ống nghỉ với ống đối chứng và ống thử nghiệm. Thổi nhẹ để chuyển muỗi từ ống nghỉ sang ống đối chứng và ống tiếp xúc. Đặt ống tiếp xúc có muỗi theo chiềuthẳng đứng, thời gian tiếp xúc 60 phút. Theo dõi để nhiệt độ và ẩm độ đạt yêu cầu của thử nghiệm.

-           Quan sát, đếm, ghi số lượng muỗi ngã gục (knock-down) vào các thời điểm 10,15,20,30,40,50 và60 phút khi muỗi bắt đầu tiếp xúc với hoá chất.

-            Chuyển muỗi từ ống đối chứng và ống thử nghiệm sang ống nghỉ. Đặt ống thẳng đứng cho muỗi nghỉ 24 giờ. Cho muỗi hút nước đường glucose 10%. Theo dõi nhiệt độ và ẩm độ trong thời gian này. Đọc kết quả thử nghiệm sau 24 giờ theo công thức sau:

  • Đối với lô đối chứng:

-           Tỉ lệ muỗi chết lớn hơn 20%:kết quả thử nghiệm không được chấp nhận, làm lại thử nghiệm.

-           Tỉ lệ muỗi chết 5 - 20%: kết quả thử nghiệm phải được điều chỉnh lại theo công thức của Abbott.

-           Tỉ lệ muỗi chết nhỏ hơn 5%: kết quả thử nghiệm được chấp nhận.

  • Đối với lô thử nghiệm:

-           Tỉ lệ muỗi chết từ 98 - 100%: muỗi nhạy với hoá chất thử nghiệm.

-           Tỉ lệ muỗi chết từ 80 - 97 %: muỗi tăng sức chịu đựng với hoá chất thử nghiệm.

-           Tỉ lệ muỗi chết nhỏ hơn 80%: muỗi kháng với hoá chất thử nghiệm.

2.5.  Phương pháp điện di enzyme

-           Phương pháp điện di gel polyacrylamide

Gel SDS (sodium dodecyl sulphate) PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)chứa 10% polyacrylamide được sử dụng trong gel tách và 4% polyacrylamide được sử dụng trong gel cô.

Gel tách 10%. APS (ammonium persulphate)được pha mới khi chuẩn bị gel và TEMED là thành phần được bổ sung cuối cùng. Cồn 70% được sử dụng để làm cân bằng mặt thoáng của gel tách và được làm khô bằng giấy thấm trước khi đổ gel cô.

Gel cô 4%. Tương tự như đối với gel tách, APS cũng được chuẩn bị mới khi sử dụng để đổ gel và TEMED được bổ sung sau cùng.

20 µL mẫu protein được trộn với 5 µL buffer mỗi SDS chứa β-mercaptoethanol. Mẫu protein sau đó được đun nóng ở 90oC trong 5 phút để làm biến tình protein. Toàn bộ 25 μl mẫu được bổ sung vào mỗi giếng điện di. Gel được chạy trong 1× bufer tris/glycine/SDS ở hiệu điện thế 100 V trong khoảng 2 giờ hoặc đến lúc thuốc nhuộm protein chạm đến đáy của gel.

-           Phương pháp nhuộm enzyme

Sau khi điện di kết thúc, enzyme esterase được nhuộm đặc hiệu cơ chất, coenzyme (NAD, NADP, NADH) và các chất tạo màu (NBT, Fast blue, Fast Garnet, Fast black, PMS).

  1. Kết quả vàthảo luận

3.1.  Thử nghiệm sinh học

Nhóm loài muỗi An. maculatus được thu thập tại bốn địa phương thuộc khu vực miền Trung và Tây Nguyên được sử dụng để thử nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng nhóm pyrethroides α-cypermethrine và λ- cyhalothrine. Kết quả thử nhạy cảm thu được cho thấy, đối với nhóm muỗi thu thập tại Bình Định tỷ lệ ngã gục tăng dần theo thời gian thử nghiệm và đạt cực đại là 100% muỗi ngã gục sau 60 phút thử nghiệm. Điều đặc biệt là cả hai loại hóa chất thử nghiệm đều cho kết quả tương đối giống nhau, tức là tỉ lệ ngã gục không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, tiếp tục kéo dài thời gian thử nghiệm cho thấy, sau 24 giờ, số cá thể chết lần lư1  ợt là 92% và 73% đối với hóa chất α-cypermethrine và λ-cyhalothrine. Điều đó chứng tỏ loài muỗi thử nghiệm này đã tăng sức chịu đựng đối với hóa chất α-cypermethrine và kháng với hóa chất λ- cyhalothrine dựa trên công thức đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới.

Kết quả thử nhạy cảm đối với nhóm muỗi thu thập tại Đắc Lắc cho thấy tỷ lệ ngã gục cũng tăng dần theo thời gian thử nghiệm như đối với công thức thử nghiệm với muỗi thu thập tại Bình Định.Sau 24 giờ thử nghiệm thì số cá thể chết lần lượt là 79% và 75% đối với hóa chất α-cypermethrine và λ- cyhalothrine. Đánh giá theo công thức thử nghiệm của Tổ chức Y tế thế giới thì nhóm loài muỗi thu thập tại Đắc Lắc đã kháng với cả hai loạihóa chất thử nghiệm.

Kết quả thử nghiệm đối với nhóm loài muỗi thu thập được tại Phú Yên cho thấy mặc dù tỉ lệ ngã gục sau 60 phút thử nghiệm là 100%, tuy nhiên tỷ lệ chết sau 24 giờ thử nghiệm là 76% và 87% lần lượt với hai hóa chất α-cypermethrine và λ- cyhalothrine. Điều đó cho thấy, nhóm loài muỗi thu thập được tại Phú Yên đã kháng với hóa chất α-cypermethrine và tăng sức chịu đựng với hóa chất λ- cyhalothrine.

Kết quả sau 24 giờ thử nghiệm đối với nhóm loài muỗi thu thập được tại Quảng Trị cho thấy tỷ lệ muỗi chết thu được lần lượt là 84% và78% đối với hai loại hóa chất thử nghiệm. Điều đó cho thấy, nhóm loài muỗi thu thập được tại Quảng Trị đã tăng sức chịu đựng đối với hóa chất α-cypermethrine và đã kháng lại hóa chất λ- cyhalothrine.

Kết luận sơ bộ là nhóm loài muỗi thử nghiệm An.maculatus được thu thập các địa phương khác nhau của miền Trung và Tây Nguyên có phản ứng khác nhau với hai loại thuốc diệt côn trùng thuộc nhóm pyrethroides là α-cypermethrine và λ- cyhalothrine. Nhưng nhìn chung loài muỗi này hoặc là đã tăng sức chịu đựng hoặc là đã kháng với các hóa chất thử nghiệm.

3.2.  Kết quả điện di enzyme esterase

Đối với loài đối chứng An. dirus

Một trong những nguyên nhân làm tăng tính kháng hóa chất của côn trùng là do những thay đổi về mặt cấu trúc hoặc tăng hàm lượng của enzyme giải độc tế bào [8,9].Isozyme carboxylesterase (E.C:3.1.1.1) thuộc nhóm esterase là một trong những enzyme quan trọng liên quan đến tính kháng thuốc ở côn trùng. Hàm lượng của enzyme này càng cao thì khả năng kháng thuốc càng mạnh.Theo tác giả Trịnh Đình Đạt và cộng sự khi phân tích hệ isozyme esterase của ba loài muỗi truyền bệnh sốt rét cho thấy hệ isozyme esterase của ba loài này mang tính đa hình rõ rệt. Một số công bố khác cũng cho thấy tần số alen cao và có băng điện di đậm trên gel SDS PAGE thì thể hiện tính kháng cao với thuốc diệt côn trùng [4].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp nhuộm màu đặc hiệu với enzyme esterase trên gel SDS PAGE để phân tích tính kháng hóa chất của nhóm loài muỗi An.maculatus và nhóm đối chứng An. dirus. Băng có kích thước nhỏ nhất (chạy nhanh nhất trên bản điện di), gọi là Est-1, được sử dụng làm băng cơ sở để phân tích tính kháng, tức là mức độ bắt màu đậm nhạt của băng này biểu thị mức độ hoạt động của enzyme esterase. Kết quả nhuộm màu esterase đối với muỗi đối chứng An. dirusđược thể hiện trên hình 1 cho thấy mức độ bắt màu của băng cơ sở đồng đều nhau và tương đối nhạt, phù hợp với kết quả của các phép thử sinh học (100% An. dirus nhạy với thuốc thử).

Đối với loài thí nghiệm An. maculatus

Dựa trên thí nghiệm thử sinh học, nếu sắp xếp từ tính kháng đến khả năng nhạy cảm đối với thuốc thử α-cypermethrine thì kết quả được sắp xếp như sau: Đắc Lắc (kháng), Phú Yên (kháng), Quảng Trị (tăng sức chịu đựng) và Bình Định (nhạy); đối với thuốc thử λ-cyhalothrin: Bình Định (kháng), Đắc Lắc (kháng), Quảng Trị (kháng) và Phú Yên (tăng sức chịu đựng). So sánh kết quả thử sinh học với nhuộm esterase trên gel SDS PAGE cho thấy nếu so sánh đồng thời với cả hai loại thuốc thử thì kết quả nhuộm esterase không phù hợp với kết quả thử sinh học (Hình 1-4). Tuy nhiên, nếu phân tích riêng từng hóa chất thử thì đối với chất λ-cyhalothrin cho kết quả tương đồng với kết quả thử sinh học, tức là mức độ đậm nhạt của băng Est-1 giảm dần từ các mẫu Bình Định, Đắc Lắc, Quảng Trị và Phú Yên. Tuy nhiên, nếu phân tích với thuốc thử α-cypermethrine thì cho kết quả không phù hợp với phép thử sinh học.

 Esterase là nguyên nhân gây ra tính kháng ở các hóa chất diệt côn trùng chứa các liên kết este như OP và Car. Trong nhiều trường hợp, tính kháng hóa chất của côn trung tăng lên do những thay đổi về cấu trúc phân tử của enzyme hoặc tăng cường mức độ biểu hiện của gene mã hóa cho các nhóm enzyme liên quan đến quá trình giải độc của tế bào. Đột biến gene là thay đổi cấu trúc phân tử, cấu trúc không gian cũng như vị trí của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme tăng hoạt tính xúc tác. Ngoài ra, mức độ biểu hiện gene tăng lên do những áp lực về hóa chất làm tăng nồng độ enzyme trong tế bào và tăng hoạt tính xúc tác chuyển hóa các hóa chất độc thành các chất không độc hoặc ít độc hơn. Pasteur và Singer (1975-1978) đã phát hiện thấy tính kháng thuốc phospho hữu cơ ở loài Culex quinquefasciatus có liên quan đến hoạt tính của enzyme esterase. Chẳng hạn như ở muỗi kháng DDT do trong cơ thể có enzyme DDTase hoạt động, nó khử clo của phân tử DDT, chuyển DDT thành DDE là hợp chất không có tính độc cho với côn trùng [5].

Việc xây dựng chiến lược phòng chống các loại vector truyền bệnh căn cứ vào phản ứng của vector với hoá chất ở từng địa phương. Ở Việt Nam, từ những năm 1990 các hoá chất thuộc nhóm pyrethroid như: permethrine (Imperator), λ-cyhalothrine (Icon), Δ-methrine (K’Othrine), α-cypermethrine (Fendona)… đã được đưa vào sử dụng để phòng chống muỗi sốt rét. Hằng năm, thử nghiệm nhạy kháng được tiến hành thường xuyên để đánh giá phản ứng của muỗi với hoá chất. Theo công trình nghiên cứu của Trương Văn Có (2005), trong giai đoạn từ 1996 đến 1998, các thử nghiệm ở khu vực miền Trung vàTây Nguyên đã xác định An. minimus nhạy với tất cả các loại hoá chất trong nhóm pyrethroid, trong khi đó An. vagus, An. barbirostris An. sinensis kháng với permethrin. Trong giai đoạn từ 1999 đến 2003, danh sách muỗi Anopheles kháng với permethrine tăng thêm hai loài là An. philippinensisAn. maculatus [2]. Đến năm 2004, nhiều loài Anopheles có hiện tượng tăng sức chịu đựng hay kháng đối với các hoá chất này, tuy nhiên hai vector chính là An. minimusAn. dirus chỉ tăng sức chịu đựng ở một số địa phương [3, 6]. Tuy nhiên trong vòng mấy năm trở lại đây do việc lạm dụng hoá chất trong nông nghiệp, đã làm các loài côn trùng trong đó có muỗi Anopheles kháng với hoá chất. Kháng hoá chất ở các vector truyền bệnh sẽ ảnh hưởng trực tiếp và sâu sắc tới sự xuất hiện trở lại của các bệnh do vector truyền bệnh. Tại những địa phương mà tính kháng hoá chất của côn trùng chưa ảnh hưởng tới sự xuất hiện của dịch bệnh thì nó cũng đe dọa sự khống chế dịch bệnh. Chính vì vậy những hiểu biết về tính kháng hoá chất diệt côn trùng ở các vector truyền bệnh có thể giúp đề ra các chiến lược phù hợp để phòng trừ dịch bệnh [7,10].

  1. Kết luận

1)       Nhóm loài muỗi An. maculatus đã kháng và tăng sức chịu đựng cao với hai loại hóa chất đang được sử dụng trong chương trình phòng chống sốt rét quốc gia là α-cypermethrine và λ-cyhalothrine tại các điểm nghiên cứu.

2)       Họ enzyme esterase có thể sử dụng như một chỉ thị bước đầu để đánh giá về mức độ nhạy và kháng của các loài Anopheles.

Lời cảm ơn: Cảm ơn TS. Nguyễn Minh Hùng, Viện Nghiên cứu và Phát triển, Trường Đại học Duy Tân đã đọc, chỉnh sửa và biên tập bản thảo này.

Tài liệu tham khảo

  1. Nguyễn Thị Hương Bình (2009), Nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của nhóm loài An. maculatustại Việt Nam. Luận án Tiến Sỹ Sinh Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
  2. Trương Văn Có (2005), “Thực trạng nhạy kháng của Anopheles với hoá chất diệt , hiệu lực tồn lưu trên màn tẩm và tường vách ở khu vực Miền Trung - Tây nguyên”, Tạp chí Y học Thực hành, Bộ Y Tế xuất bản, số 511: tr 116-121
  3. Nguyễn Thị Duyên (2009), Nghiên cứu quần thể Anopheles minimus tại xã Bình Thạnh, Huyện Tuy Phong, Tỉnh Bình Thuận. Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
  4. Trịnh Đình Đạt, Trương Quang Học, Ngô Giang Liên (1991), “Nghiên cứu một số hệ isozym ở nhóm loài muỗi sốt rét Anopheles minimus, Theobal, 1901 (diptera culicidae) ở Việt Nam”, Hội nghị côn trùng học quốc gia Việt Nam lần thứ nhất, Hà Nội, tr. 47.
  5. Lương Thị Liên (2002), Nghiên cứu tính kháng thuốc trừ sâu và hiện tượng đa hình enzyme Esterase của ba quần thể sâu tơ ở ngoại thành Hải Phòng, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội.
  6. Đào Minh Trang (2008), Nghiên cứu hoạt tính một số enzyme liên quan đến tính kháng hóa chất diệt côn trùng ở muỗi Anopheles minimus phân bố tại miền Bắc Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
  7. Brogdon WG., (1989), “Biochemical resistance detection: an alternative to bioassay”, Parasitology Today, 5, pp.56-60.
  8. James A. Ferrary, (1996), ‘’Insecticide resistance’’ The Biology of Disease Vectors, pp. 512-516.
  9. Hemingway Janet and Hilary Ranson, (2000), “Insecticide resistance in Insec Vectors of Human Disease”, Annu.Rev.Entomol., 45, pp.371-391.
  10. Rodriguez M.M., Bisset J. Ruiz M., Soca A., (2000), “Cross-reistance to pyrethroid and organophosphate insecticides, selection with temephos in Aedes aegypti in Cuba”.
  11. WHO, (1993), A global strategy for malaria control, Geneva.
  12. WHO, (1993), A global strategy for malaria control, Geneva.
  13. WHO, (1998), Techniquesto detect insecticide resistance mechanism, WHO/CDS/CPC/MAL/98.6.
  14. WHO, (1998), Test procedure for insecticide resistance monitoring in malaria vectors, bio-efficacy and persistence of insecticide on treated surfaces, WHO/CDS/CPC/MAL/98.12.

Các tin khác